本期講堂，作為PCR基礎(chǔ)知識(shí)的開篇，我們先來了解一下最基礎(chǔ)的PCR原理、操作流程、成功的要素這三部分內(nèi)容。

PCR作為一項(xiàng)基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，由于操作簡便、省時(shí)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在生物科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛：從克隆、基因編輯、下一代測(cè)序（NGS）到基因分型、法醫(yī)zhencha、病原鑒定等，都離不開PCR技術(shù)的助力分析。

首先我們先來了解一下PCR的原理，

一、PCR原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

理論上，每一輪循環(huán)可使DNA的數(shù)量增加一倍，經(jīng)過n次循環(huán)后，反應(yīng)混合物中所含的DNA數(shù)量為2n。

二、PCR操作流程

①DNA制備

從樣品中提取PCR反應(yīng)所需的DNA模板、直接PCR無需此步。
推薦商品化的核酸提取試劑，節(jié)省時(shí)間、簡化操作流程、減少DNA提取量的損失。

②PCR反應(yīng)

包括反應(yīng)液的制備和PCR反應(yīng)兩個(gè)步驟。

反應(yīng)液的制備
普通PCR的反應(yīng)體系由DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、4 種dNTP、引物及靶序列DNA模板這五大要素組成。商品化的DNA聚合酶，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應(yīng)緩沖液，因此僅需我們準(zhǔn)備引物及DNA模板，并且根據(jù)說明書推薦量進(jìn)行反應(yīng)液配制即可。

PCR反應(yīng)
選擇適宜的梯度PCR儀，根據(jù)擴(kuò)增片段大小及酶制品說明書推薦來進(jìn)行PCR反應(yīng)條件設(shè)置。

③電泳、染色

PCR反應(yīng)后，通過凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段大小。

三、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、4 種dNTP、引物及靶序列DNA模板是構(gòu)成PCR反應(yīng)組分的五大要素，這是影響PCR成功的內(nèi)因；PCR反應(yīng)條件的設(shè)置，是影響PCR成功的外因。

酶 

之前提到過商品化的DNA聚合酶，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應(yīng)buffer，因此酶的選擇至關(guān)重要，我們需要兼顧保真性、擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增速度、擴(kuò)增效率、模板復(fù)雜程度及擴(kuò)增片段長度等，選擇最適PCR酶。

引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR反應(yīng)引物的濃度一般在0.1μm~1μm之間，以zuidi引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

模板

模板的完整性要好，模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物。同時(shí)模板純度也盡量越純?cè)胶?，純度不好，可用PCI（苯酚氯仿抽提）及EtOH（乙醇沉淀 ）精制。

模板添加量可以參考酶制品說明書及下表的建議模板量進(jìn)行添加，加量過多會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加：

反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件可以參考酶制品說明書及下表進(jìn)行設(shè)置：

四、常見問題

1.假陰性

不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

2.陰性

需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。

3.假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。